鼻咽癌组织中EB病毒的不同原位检测方法比较
作者：许亮国 姚开泰 谢鹭 周文 杨玉文 陈曲侯 王睤章
单位：许亮国 姚开泰 谢鹭 周文 杨玉文(湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，湖南长沙410078)；陈曲侯 王睤章(中山大学生命科学院，广东广州510275)
关键词：原位杂交；原位PCR；EBER-1；EB病毒
癌症000108
摘 要：目的：探讨在鼻咽癌组织石蜡切片标本中原位检测EB病毒的更快速、更灵敏的方法。方法：用地高辛标记的寡核苷酸EBER-1和EBVDNA的BamHI-W片段为探针,分别用原位杂交、原位PCR检测鼻咽癌组织切片中EBV的分布情况。结果：用寡核苷酸EBER-1作探针原位杂交检测EB病毒的方法比用BamHI-W片段作探针原位杂交及原位PCR的方法更灵敏、更简单。结论：用EBER-1作探针原位杂交检测鼻咽癌组织切片中EB病毒的方法不失为一种简单、快速、灵敏的方法。
, 百拇医药
分类号：R73;R739.63 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-0031-03
Comparison of different methods for in situ detection of
Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma
XU Liang-guo
(Key Laboratory of Carcinogenesis Mechanism of Ministry of Health, Hunan Medical University,Changsha 410078,P.R.China)
, 百拇医药 (School of Life Science, Zhongshan University,Guangzhou 510275,P.R.China)
YAO Kai-tai1, XIE Lu1, et al.
(School of Life Science, Zhongshan University,Guangzhou 510275,P.R.China)
Abstract：Objective：To investigate a rapid, sensitive non isotopic method for in situ detection of Epstein Barr virus (EBV) in paraffin-embedded section of nasopharyngeal carcinoma (NPC) tissues. Methods： The oligo-nucleotide EBER-1 and EBV BamHI-W fragment were labeled with digoxigenin as probes,in situ hybridization and PCR in situ hybridization were performed to detect EBV distribution in NPC tissues. Results：The signal strength of in situ hybridization with EBER-1 oligonucleotide probe was clearly stronger than that of in situ hybridization and PCR in situ hybridization with BamHI-W fragment probe. Conclusion： In situ hybridization with EBER-1 probe to detect EBV in NPC tissues is a sensitive, simple and rapid method.
, 百拇医药
Key words：In situ hybridization； In situ PCR； EBER-1； Epstein-Baar virus ▲
Epstein-Barr病毒(EBV)与鼻咽癌(NPC)具有非常密切的关系[1,2]。各家检测EBV DNA的方法均不完全相同,灵敏度也存在差异[2,3,6,9,11]。原位杂交是比较传统的方法,但很难检测低拷贝数DNA或RNA在细胞内的存在,近几年来用来提高检测灵敏度而出现的原位PCR技术也正在逐步成熟并得到推广[5,8],但对于检测NPC组织中的EB病毒而言,哪种方法更灵敏、更简单,尚未平行比较过。为此,我们将原位PCR技术用来检测EB病毒,并将它与传统的原位杂交技术相比较,以探讨检测NPC组织中EB病毒的相对灵敏、简单的方法。
1材料和方法
1.1材料
, 百拇医药
鼻咽部活检组织石蜡包埋切片标本由湖南省肿瘤医院病理科提供,共23例,均为近1年内存档标本,按常规福尔马林固定、石蜡包埋、连续切片(4μm厚),取连续切片标本分别进行原位杂交、原位PCR及常规苏木素伊红(HE)染色。
1.2方法
1.2.1原位杂交：EBER-1探针按文献[6]设计,在湖南医科大学肿瘤所合成，按Boehringer Mannheim公司Dig Oligonucleotide3’-End Labeling Kit(Cat.No.1362372)说明书标记。杂交前切片经脱蜡、水化、蛋白酶K处理,每片滴加20μl杂交液(25%甲酰胺，4×SSC,50mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4,1mol/LEDTA,5×Denhart's,1mg/mlssDNA,探针浓度为100ng/ml),蜡膜覆盖,橡胶水封片,70℃变性6分钟,37℃杂交过夜。然后用2×SSC,0.1×SSC在室温下各洗脱2次,每次10分钟，去除未杂交信号,用Boehringer Mannheim公司Dig DNA Labelingand Detecting Kit(Cat.NO.1093657)进行检测,信号位于胞核中,为紫蓝色沉淀。
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BamHI-W片段由重组pBR322质粒(中科院上海细胞生物所引进)中酶切回收,用Boehringer Mannheim公司Dig DNA Labeling and Detection Kit进行标记,切片标本按前法处理后,每片滴加20μl杂交液(50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，4×SSC，5×Denhart's，1mg/mlssDNA，探针浓度为1mg/ml),蜡膜覆盖,橡胶水封片。94℃变性8分钟后,42℃杂交过夜。然后用4×SSC,0.1×SSC各洗脱2次,每次10分钟，按前法进行检测。
1.2.2原位PCR：设计扩增片段长度为241bp,位于EBVDNA中的W片段,引物序列为：引物EW1：5'-TTTGGACCCGAAATCTGA-3'(14007-14024),引物EW2∶5'-GCCCTGACCTTTGGTGA-3(14231-14247),由美国生命技术公司合成。切片经脱蜡、水化、蛋白酶K消化后,每片滴加PCR反应液20μl[50mmol/LKCl,10mmol/LTris.Cl(pH8.3),4.5mmol/LMgCl2,0.1%Triton-X100,200μmol/LeachdNTP,引物浓度为0.5μmol/L,2UnitTaq酶],盖玻片覆盖,指甲油封边。循环条件为：94℃,5分钟变性后,94℃1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,30个循环,72℃延伸10分钟。PCR反应结束后,去盖玻片,按前述方法用Dig标记的BamHI-W片段作探针原位杂交后进行检测,并设立无探针对照、无引物对照及无EBVDNA的阴性对照。
, 百拇医药
2结果
共比较了23例标本,鼻咽低分化鳞癌16例,慢性鼻咽炎4例,鼻咽部不典型增生3例。其中,3例慢性鼻咽炎各检测方法结果均为EBV阴性;3例不典型增生病例中,2例各方法检测结果均为EBV阴性,另1例W片段探针原位杂交检测结果阴性,但原位PCR和EBER-1原位杂交检测结果阳性;其余16例鼻咽低分化鳞癌标本各检测方法结果均为EBV阳性,只是存在不同检测方法间的信号强度及癌细胞EBV阳性率有差异。对于BamHI-W片段作探针来说原位PCR后杂交信号比单独原位杂交的信号要强,且癌细胞EBV阳性率也要高,说明原位PCR比原位杂交检测方法灵敏度高;但用EBER1作探针行原位杂交后的信号比原位PCR更强,而且细胞轮廓更清晰,见图1～4。
图1显示NPC切片标本中一癌巢(HE×400)；
, 百拇医药
图2显示NPC切片标本中EBV-W片段原位杂交结果(×40)；
图3显示NPC切片中EBV-W片段原位PCR结果(×400)；
图4显示NPC切片标本中EBER-1原位杂交结果(×400)；
图1～4均为同一例EBV阳性的鼻咽低分化鳞癌的相邻切片
3讨论
90年代以来,出现了将PCR的高效扩增与细胞定位相结合的原位PCR技术[5,7,8],通过原位PCR能将靶片段扩增200～300倍[8],检测灵敏度远远高于原位杂交。原位PCR用于检测外源DNA特别是病毒DNA的报道已有很多[1,4,5,7,8],但用于检测EB病毒的报道并不多[9]。我们成功地运用这一方法检测EB病毒。实验中,选择扩增靶片段长度为241bp,在适当蛋白酶K浓度处理下,并没有出现产物扩散现象;通过设立相邻切片的无探针对照、无Taq酶对照、无引物对照及无EB病毒的阴性标本对照,可以有效地排除假阳性结果;另外,采用的间接法原位PCR所获得的结果也更可靠。
, 百拇医药
用非同位素标记寡核苷酸EBER作探针来原位检测NPC组织中的EB病毒,也是近几年来发展起来的方法。用寡核苷酸作探针的检测效果本身并不很敏感,每个分子只能在3'或5'端标记上1个能被检测到的分子,如Dig或Biotin等,一般来说检测灵敏度比其它方法标记的长片段cDNA或DNA作探针差。但就NPC标本来说,EBV转录的EBER拷贝数可高达每个细胞10[6，7，10，11],这就使得用EBER反义寡核酸作探针检测EBV的灵敏度大大提高,甚至超过原位PCR。另外由于EBER探针短,所需的蛋白酶K消化时间短,所以细胞形态也能保持更好。
基金项目：本课题受国家自然科学基金重点项目资助(No.39730200)
通讯作者：Tel：86-731-4360094
Fax：86-731-4360094
Email：klcarcmh@public.cs.hn.cn
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参考文献：
[1]Klein G. The Epstein-Barr Vrius[M]. Berlin： Springer, 1979： 339～ 350.
[2]游绍进，姚开泰，曹亚，等.Epstein-Barr病毒潜伏状态与鼻咽癌的关系[J].中华肿瘤杂志,1996，18(1)：23～26.
[3]蒋晓群，姚开泰.鼻咽及其邻近部位各类型癌组织中EBV DNA的原位检测[J].中华病理学杂志,1994，18(2)：85～88.
[4]Nuovo GJ, Gallery F, Macconnel P, et al. An improved technique for the in situ detection of DNA after polymerase chain reaction amplification[J]. Am J Pathol,1991,139： 1239～ 1244.
, http://www.100md.com
[5]苏慧慈,刘彦仿.原位PCR[M].北京：科学出版社,1995：25～68.
[6]Khan G, Coates P J, Kangro HO, et al. Epstein-Barr Virus(EBV)encoded small RNAs： targets for detection by in situ hybridization with oligonucleotide probes[J]. J Clin Pathol 1992,45： 616～ 620.
[7]Haase AT, Retzel EF, Staskus KA. Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1990, 87： 4971～ 4975.
[8]Nuovo GJ. PCR in situ hybridization, protocols and applications[M]. New York： Raven Press, 1992： 56～ 125.
, 百拇医药
[9]Ohshima K, Kikuahi M, Kobari S, et al. Demonstration of Epstein virus genomes,using polymerase chain reaction in situ hybridization in paraffin-embedded lymphoid tissues[J]. Pathol Res Pract, 1995,191(2)： 139～ 147.
[10]Lerner MR,Andrews NC, Miller G, et al. Two Small RNAs encoded by Epstein-Barr virus and complexed with protein are precipitated by antibodies from patients with systemic lupus erythematosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1981,78： 805～ 809.
[11]Glickman JN, Howe JG, Steitz,JA. Structural analysis of EBER-1 and EBER-2 ribonucleoprotein particles present in Epstein-Barr virus-infected cells[J]. J Virol, 1988, 62： 902～ 911.
收稿日期：1999-03-10
修回日期：1999-08-28, 百拇医药
单位：许亮国 姚开泰 谢鹭 周文 杨玉文(湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，湖南长沙410078)；陈曲侯 王睤章(中山大学生命科学院，广东广州510275)
关键词：原位杂交；原位PCR；EBER-1；EB病毒
癌症000108
摘 要：目的：探讨在鼻咽癌组织石蜡切片标本中原位检测EB病毒的更快速、更灵敏的方法。方法：用地高辛标记的寡核苷酸EBER-1和EBVDNA的BamHI-W片段为探针,分别用原位杂交、原位PCR检测鼻咽癌组织切片中EBV的分布情况。结果：用寡核苷酸EBER-1作探针原位杂交检测EB病毒的方法比用BamHI-W片段作探针原位杂交及原位PCR的方法更灵敏、更简单。结论：用EBER-1作探针原位杂交检测鼻咽癌组织切片中EB病毒的方法不失为一种简单、快速、灵敏的方法。
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分类号：R73;R739.63 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)01-0031-03
Comparison of different methods for in situ detection of
Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma
XU Liang-guo
(Key Laboratory of Carcinogenesis Mechanism of Ministry of Health, Hunan Medical University,Changsha 410078,P.R.China)
, 百拇医药 (School of Life Science, Zhongshan University,Guangzhou 510275,P.R.China)
YAO Kai-tai1, XIE Lu1, et al.
(School of Life Science, Zhongshan University,Guangzhou 510275,P.R.China)
Abstract：Objective：To investigate a rapid, sensitive non isotopic method for in situ detection of Epstein Barr virus (EBV) in paraffin-embedded section of nasopharyngeal carcinoma (NPC) tissues. Methods： The oligo-nucleotide EBER-1 and EBV BamHI-W fragment were labeled with digoxigenin as probes,in situ hybridization and PCR in situ hybridization were performed to detect EBV distribution in NPC tissues. Results：The signal strength of in situ hybridization with EBER-1 oligonucleotide probe was clearly stronger than that of in situ hybridization and PCR in situ hybridization with BamHI-W fragment probe. Conclusion： In situ hybridization with EBER-1 probe to detect EBV in NPC tissues is a sensitive, simple and rapid method.
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Key words：In situ hybridization； In situ PCR； EBER-1； Epstein-Baar virus ▲
Epstein-Barr病毒(EBV)与鼻咽癌(NPC)具有非常密切的关系[1,2]。各家检测EBV DNA的方法均不完全相同,灵敏度也存在差异[2,3,6,9,11]。原位杂交是比较传统的方法,但很难检测低拷贝数DNA或RNA在细胞内的存在,近几年来用来提高检测灵敏度而出现的原位PCR技术也正在逐步成熟并得到推广[5,8],但对于检测NPC组织中的EB病毒而言,哪种方法更灵敏、更简单,尚未平行比较过。为此,我们将原位PCR技术用来检测EB病毒,并将它与传统的原位杂交技术相比较,以探讨检测NPC组织中EB病毒的相对灵敏、简单的方法。
1材料和方法
1.1材料
, 百拇医药
鼻咽部活检组织石蜡包埋切片标本由湖南省肿瘤医院病理科提供,共23例,均为近1年内存档标本,按常规福尔马林固定、石蜡包埋、连续切片(4μm厚),取连续切片标本分别进行原位杂交、原位PCR及常规苏木素伊红(HE)染色。
1.2方法
1.2.1原位杂交：EBER-1探针按文献[6]设计,在湖南医科大学肿瘤所合成，按Boehringer Mannheim公司Dig Oligonucleotide3’-End Labeling Kit(Cat.No.1362372)说明书标记。杂交前切片经脱蜡、水化、蛋白酶K处理,每片滴加20μl杂交液(25%甲酰胺，4×SSC,50mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4,1mol/LEDTA,5×Denhart's,1mg/mlssDNA,探针浓度为100ng/ml),蜡膜覆盖,橡胶水封片,70℃变性6分钟,37℃杂交过夜。然后用2×SSC,0.1×SSC在室温下各洗脱2次,每次10分钟，去除未杂交信号,用Boehringer Mannheim公司Dig DNA Labelingand Detecting Kit(Cat.NO.1093657)进行检测,信号位于胞核中,为紫蓝色沉淀。
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BamHI-W片段由重组pBR322质粒(中科院上海细胞生物所引进)中酶切回收,用Boehringer Mannheim公司Dig DNA Labeling and Detection Kit进行标记,切片标本按前法处理后,每片滴加20μl杂交液(50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，4×SSC，5×Denhart's，1mg/mlssDNA，探针浓度为1mg/ml),蜡膜覆盖,橡胶水封片。94℃变性8分钟后,42℃杂交过夜。然后用4×SSC,0.1×SSC各洗脱2次,每次10分钟，按前法进行检测。
1.2.2原位PCR：设计扩增片段长度为241bp,位于EBVDNA中的W片段,引物序列为：引物EW1：5'-TTTGGACCCGAAATCTGA-3'(14007-14024),引物EW2∶5'-GCCCTGACCTTTGGTGA-3(14231-14247),由美国生命技术公司合成。切片经脱蜡、水化、蛋白酶K消化后,每片滴加PCR反应液20μl[50mmol/LKCl,10mmol/LTris.Cl(pH8.3),4.5mmol/LMgCl2,0.1%Triton-X100,200μmol/LeachdNTP,引物浓度为0.5μmol/L,2UnitTaq酶],盖玻片覆盖,指甲油封边。循环条件为：94℃,5分钟变性后,94℃1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,30个循环,72℃延伸10分钟。PCR反应结束后,去盖玻片,按前述方法用Dig标记的BamHI-W片段作探针原位杂交后进行检测,并设立无探针对照、无引物对照及无EBVDNA的阴性对照。
, 百拇医药
2结果
共比较了23例标本,鼻咽低分化鳞癌16例,慢性鼻咽炎4例,鼻咽部不典型增生3例。其中,3例慢性鼻咽炎各检测方法结果均为EBV阴性;3例不典型增生病例中,2例各方法检测结果均为EBV阴性,另1例W片段探针原位杂交检测结果阴性,但原位PCR和EBER-1原位杂交检测结果阳性;其余16例鼻咽低分化鳞癌标本各检测方法结果均为EBV阳性,只是存在不同检测方法间的信号强度及癌细胞EBV阳性率有差异。对于BamHI-W片段作探针来说原位PCR后杂交信号比单独原位杂交的信号要强,且癌细胞EBV阳性率也要高,说明原位PCR比原位杂交检测方法灵敏度高;但用EBER1作探针行原位杂交后的信号比原位PCR更强,而且细胞轮廓更清晰,见图1～4。
图1显示NPC切片标本中一癌巢(HE×400)；
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图2显示NPC切片标本中EBV-W片段原位杂交结果(×40)；
图3显示NPC切片中EBV-W片段原位PCR结果(×400)；
图4显示NPC切片标本中EBER-1原位杂交结果(×400)；
图1～4均为同一例EBV阳性的鼻咽低分化鳞癌的相邻切片
3讨论
90年代以来,出现了将PCR的高效扩增与细胞定位相结合的原位PCR技术[5,7,8],通过原位PCR能将靶片段扩增200～300倍[8],检测灵敏度远远高于原位杂交。原位PCR用于检测外源DNA特别是病毒DNA的报道已有很多[1,4,5,7,8],但用于检测EB病毒的报道并不多[9]。我们成功地运用这一方法检测EB病毒。实验中,选择扩增靶片段长度为241bp,在适当蛋白酶K浓度处理下,并没有出现产物扩散现象;通过设立相邻切片的无探针对照、无Taq酶对照、无引物对照及无EB病毒的阴性标本对照,可以有效地排除假阳性结果;另外,采用的间接法原位PCR所获得的结果也更可靠。
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用非同位素标记寡核苷酸EBER作探针来原位检测NPC组织中的EB病毒,也是近几年来发展起来的方法。用寡核苷酸作探针的检测效果本身并不很敏感,每个分子只能在3'或5'端标记上1个能被检测到的分子,如Dig或Biotin等,一般来说检测灵敏度比其它方法标记的长片段cDNA或DNA作探针差。但就NPC标本来说,EBV转录的EBER拷贝数可高达每个细胞10[6，7，10，11],这就使得用EBER反义寡核酸作探针检测EBV的灵敏度大大提高,甚至超过原位PCR。另外由于EBER探针短,所需的蛋白酶K消化时间短,所以细胞形态也能保持更好。
基金项目：本课题受国家自然科学基金重点项目资助(No.39730200)
通讯作者：Tel：86-731-4360094
Fax：86-731-4360094
Email：klcarcmh@public.cs.hn.cn
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参考文献：
[1]Klein G. The Epstein-Barr Vrius[M]. Berlin： Springer, 1979： 339～ 350.
[2]游绍进，姚开泰，曹亚，等.Epstein-Barr病毒潜伏状态与鼻咽癌的关系[J].中华肿瘤杂志,1996，18(1)：23～26.
[3]蒋晓群，姚开泰.鼻咽及其邻近部位各类型癌组织中EBV DNA的原位检测[J].中华病理学杂志,1994，18(2)：85～88.
[4]Nuovo GJ, Gallery F, Macconnel P, et al. An improved technique for the in situ detection of DNA after polymerase chain reaction amplification[J]. Am J Pathol,1991,139： 1239～ 1244.
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[5]苏慧慈,刘彦仿.原位PCR[M].北京：科学出版社,1995：25～68.
[6]Khan G, Coates P J, Kangro HO, et al. Epstein-Barr Virus(EBV)encoded small RNAs： targets for detection by in situ hybridization with oligonucleotide probes[J]. J Clin Pathol 1992,45： 616～ 620.
[7]Haase AT, Retzel EF, Staskus KA. Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1990, 87： 4971～ 4975.
[8]Nuovo GJ. PCR in situ hybridization, protocols and applications[M]. New York： Raven Press, 1992： 56～ 125.
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[9]Ohshima K, Kikuahi M, Kobari S, et al. Demonstration of Epstein virus genomes,using polymerase chain reaction in situ hybridization in paraffin-embedded lymphoid tissues[J]. Pathol Res Pract, 1995,191(2)： 139～ 147.
[10]Lerner MR,Andrews NC, Miller G, et al. Two Small RNAs encoded by Epstein-Barr virus and complexed with protein are precipitated by antibodies from patients with systemic lupus erythematosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1981,78： 805～ 809.
[11]Glickman JN, Howe JG, Steitz,JA. Structural analysis of EBER-1 and EBER-2 ribonucleoprotein particles present in Epstein-Barr virus-infected cells[J]. J Virol, 1988, 62： 902～ 911.
收稿日期：1999-03-10
修回日期：1999-08-28, 百拇医药